Серолошки тестови на SARS-CoV-2: шта се детектује и који антигени се користе?

You are currently viewing Серолошки тестови на SARS-CoV-2: шта се детектује и који антигени се користе?

Када наш имуни систем детектује патоген, као што би требало да је случај и код ове тренутне епидемије такозваним SARS-CoV-2 вирусом, после извесног времена покреће се продукција антитела (IgM и IgG), која се затим каче на специфична места на вирусним протеинима — нпр. сегменте спајк протеина или протеине нуклеокапсида — и на тај начин воде ка уништењу вируса и инфицираних ћелија. После прележане инфекције, нека од ових антитела настављају да циркулишу у крви и могу се и даље детектовати путем серолошког теста (тј. теста на специфична антитела за дати антиген или антигене вируса који су присутни у крвном серуму или крвној плазми пацијента). Пенг Жу (Peng Zhou), истраживач са Вуханског института за вирусологију тврди да је сапјк протеин веома специфичан за SARS-CoV-2 вирус, док је протеин нуклеокапсида најзаступљенији [4]. Истраживач са Универзитета у Утрехту, Беренд-Јан Бош (Berend-Jan Bosch) тврди да је спајк протеин јако стабилан и једини који је одговоран за улазак вируса у ћелију домаћина, а слично је и са стабилношћу протеина нуклеокапсида [4].

Серолошки тестови на SARS-CoV-2, развијени су брзо, нарочито за тренутну ситуацију пандемије CoViD-19, без инсистирања на стриктним стандардима у производњи ове врсте тестова — високој сензитивности и специфичности, као и репродуцибилности, тј. укупној робусности теста. За развој робусног теста потребно је тестирање огромног броја пацијената и паралелно праћење клиничке слике и осталих параметара, као и дугорочно праћење и тестирање у различитим временским интервалима и после оздрављења. Сензитивност теста се дефинише као способност теста да детектује да ли пацијент поседује антитела на SARS-CoV-2 (позитиван узорак), док се специфичност дефинише као способност да се детктују и они који немају антитела на SARS-CoV-2 (негативан узорак) [8]. Ово је битно нагласити из разлога што ови серолошки тестови нису прошли стандардни процес развоја за рутинску употребу у лабораторијској дијагностици, већ су одобрени условно. Дакле, они нису званично одобрени за употребу од стране Управе за храну и лекове (FDA), већ се могу користити искључиво у ауторизованим лабораторијама, и то само док је на снази привремено Одобрење за ургентну употребу (Emergency Use Authorization, EUA) услед пандемије CoViD-19. Ово упозорење пише на сваком упутству произвођача тестова који су одобрени за ову ургентну употребу (EUA) [1, 2, 5, 8].

Серолошки тестови који се користе у две највеће лабораторије (Quest Diagnostics и Lab Corp) које покривају читаве САД, као и у већини лабораторија Европске Уније се базирају на принципу тзв. сендвич-ЕLISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) теста или сродне CMIA (chemiluminescent microparticle immunoassay) технологије. ELISA је семи-квантитативна серолошка метода којом се утврђује релативан ниво антитела у крвном серуму или плазми пацијента на SARS-CoV-2 антигене теста. Због семи-квантитативне природе овог теста (релативна бројчана вредност сигнала коју детектује читач, а која се затим интерпретира на основу предетерминисане граничне вредности), различити тестови имају и нешто другачије постављене граничне вредности.

Дакле, који се вирусни антигени користе у тестовима одобреним за ургентну употребу (EUA)? Управа за храну и лекове (FDA) на њиховом сајту наводи 29 тестова који су добили ово одобрење [8]. Ту спадају и тестови који се користе у већини америчких и европских лабораторија, а о којима ћемо овде рећи нешто више.

Тест који производи комапнија Abbott, а који користи амерички лабораторијски гигант Quest Diagnostics детектује IgG (антитела) усмерна против рекомбинованог вирусног нуклеокапсида, најраспрострањенијег протеина овог вируса [1].  Други амерички гигант, Lab Corp, користи тест који је развила фирма Roche, а који такође детектује IgG усмерне против рекомбинованог вирусног нуклеокапсида, али према свом патентираном протоколу [5]. Eurimmun, чији тест користе многе европске лабораторије, детектује IgG усмерне против рекомбинованог Ѕ1-домена спајк протеина вируса [2].  Оно што је кључно нагласити је да се ради о рекомбинованим вирусним протеинима. Шта то заправо значи? Па некада су се вирусни нативни протеини добијали екстракцијом из зрелих вириона гајених у култури ћелија сисара, али се сада због брзине и количине потребне да задовољи тржиште вирусни протеини добијају тако што се експримирају у ћелијама бактерије E. coli, али и другим ћелијама које нису пореклом од сисара [7]. Протеини вируса се тако могу произвести брзо и у огромној количини, али из разлога што нису произведени у ћелијама сисара које нормално инфицирају већ у бактеријским, они могу бити нешто деформисани [4]. Могу им недостајати пост-транслацијске модификације које с друге стране могу да утичу на неаутентичну презентацију епитопа, што је од суштинског значаја за препознавање антитела [7].

У литератури је описано да су крвни серуми пацијената са високим титром антитела против два различита хумана корона вируса (HCoV-OC43 и HCoV-229E) произвели лажно позитиван резултат на ELISA тесту чији је антиген био рекомбинантни протеин нукеокапсида SARS-CoV-1 вируса. Ова крос-реактивност антитела је касније и потврђена другом методом, Western Blot, у којој је коришћен рекомбиновани спајк полипептид SARS-CoV-1 вируса, који се показао специфичнији од протеина нуклеокапсида коришћеног у ELISA тесту [9]. Крос-реактивност антитела је описана и као могући лимитирајући фактор у упутствима произвођача тестова који се користе за детекцију антитела на SARS-CoV-2 [1, 2, 5]. Поред крос-реактивности са SARS-CoV-1, описана је и унакрсна реактивност са респираторним синцицијалним вирусом (RSV), микоплазмом, као и узрочницима бактеријске пнеумоније [2].   

Др Пјер-Ив Леви (Pierre-Yves Levy) са Универзитетско-болничког института у Марсеју је изјавио да његов тим ради већ дуже време процену серолошких тестова пацијената који су код њих на лечењу због упознавања кинетике антитела — другим речима, када су произведена, колико дуго су присутна у крви пацијената, као и колики степен имунитета могу да обезбеде после прве инфекције [3]. Кинетика, тј. појава и трајање IgM и IgG антитела, је шематски приказана на слици [6]. Види се да антитела почињу да се производе почетком друге недеље од појаве симптома, да досежу пик средином треће недеље од појаве симптома, и да већ од краја четврте недеље IgM ниво опада, док се IgG задржавају дуже, али докле тачно, то тек треба да се утврди.

У упутству свих тестова одобрених за ургентну употребу (EUA) стоји следеће упозорење:

“Позитиван резултат на IgG не мора значити да су тренутни или прошли симптоми пацијента последица CoViD-19 инфекције. Резултате лабораторијског теста би увек требало узети у обзир само у контексту клиничке слике и епидемиолошких података када се даје коначна дијагноза и када се одлучује о терапији пацијента” [1, 2, 5].

Још један интересантан детаљ је да се серолошки тест на SARS-CoV-2 не препоручује за скрининг крви која се даје за трансфузију [5]. Овај податак такође указује на непоузданост овог теста и његову посве условну примену.

Коначно, исти ови тестови се користе и за детекцију неутралишућих антитела код волонтера који учествују у тестирању ефикасности вакцина против SARS-CoV-2, које развијају лабораторије и фармацеутске компаније широм света [4]. Мислите о томе пре него што добровољно пристанете на ову краткорочну “превентивну” меру која са собом носи трајна нежељена дејства.

Референце

[1] Аbbott Laboratories. (2020). SARS-COV-2 Immunoassays. https://www.corelaboratory.abbott/us/en/offerings/segments/infectious-disease/sars-cov-2

[2] Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG. (2020). Anti-SARS-CoV-2 ELISA (IgG). https://www.fda.gov/media/137609/download

[3] Ignasse, J. (2020, April 11). A l’IHU Méditerranée Infection, les tests sérologiques à l’épreuve. https://www.sciencesetavenir.fr/sante/a-l-ihu-les-tests-serologiques-a-l-epreuve_143405

[4] Petherick A. (2020). Developing antibody tests for SARS-CoV-2. Lancet (London, England), 395(10230): 1101–1102. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30788-1

[5] Roche Diagnostics. (2020). Elecsys® Anti-SARS-CoV-2. https://diagnostics.roche.com/us/en/products/params/elecsys-anti-sars-cov-2.html

[6] Sethuraman N, Jeremiah SS, Ryo A. (2020). Interpreting diagnostic tests for SARS-

CoV-2. JAMA, 323(22): 2249–2251. doi:10.1001/jama.2020.8259

[7] Spencer, K. A., Osorio, F. A., & Hiscox, J. A. (2007). Recombinant viral proteins for use in diagnostic ELISAs to detect virus infection. Vaccine, 25(30): 5653–5659. https://doi.org/   10.1016/j.vaccine.2007.02.053

[8] UЅ Food and Drug Administration. (2020). EUA Authorized Serology Test Performance. https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance

[9] Woo, P., Lau, S., Wong, B., Chan, K., Hui, W., Kwan, G., . . . Yuen, K. (2004, December 01). False-positive results in a recombinant severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid enzyme-linked immunosorbent assay due to HCoV-OC43 and HCoV-229E rectified by western blotting with recombinant SARS-CoV spike polypeptide. Journal of Clinical Microbiology, 42 (12): 5885-5888  https://jcm.asm.org/content/42/12/5885.long

Екипа Покрета Живим за Србију