Press "Enter" to skip to content

Шта је упитно код изолације SARS-CoV-2 вируса и тестова?

Шта је упитно код изолације SARS-CoV-2 вируса и тестова?

Текст приредила екипа покрета Живим за Србију

Чини се да данас обичан човек, грађанин ове државе, нема право да зна најосновније чињенице које се директно тичу његовог биолошког опстанка. Сведоци смо да и после вишемесечног готово целодневног медијског расветљавања ове посве нове ситуације из домена светског јавног здравља – како нам се предствља — обичан човек све мање и мање зна и разуме шта се заправо дешава. Вируси, епидемије и пандемије су, то знамо, постојали и пре појаве SARS-CoV-2. Зашто је овај вирус страшнији и смртоноснији од других респираторних зараза још није јасно просечном грађанину Србије.

Дакле, шта се то у међувремену догодило са три велике заразне пошасти човечанства, о којима се више готово и не говори: HIV-ом, туберкулозом и маларијом?

Шта се догодило са другим циркулишућим респираторним инфекцијама?

Да ли је диференцијална дијагностика и даље битна, или се уз нову нормалу у нашим животима полако уводи и нова дијагностика, и каквим стандардима се она руководи?

Коначно, да ли је вирус природан, и ако јесте, ко је прелазни домаћин; да ли је можда природан али модификован у лабораторији, и ако јесте, како се то догодило; или је можда вештачки (рекомбинован), што је најмање вероватно?

Ово су само нека од питања о којима размишља обичан човек, а на основу онога што му пласирају подједнако и мејнстрим и алтернативни медији. Поврх тих питања се накупљају и сва она која се тичу дневне егзистенције, додатно искомпликоване тренутним мерама јавног здравља.

Међутим, суштинска два питања на које се у Србији не даје јасан одговор су:

  1. Да ли је и како вирус изолован у Србији?
  2. Да ли су тестови који се у Србији користе стандардизовани, и шта тачно детектују?

Како би било нормално и лепо када би се група научника и лекара скупила и дала некакав консенсуални одговор на ова два питања. Инфектолози, микробиолози, пулмолози, епидемиолози, интернисти, биохемичари, молекуларни биолози, био-статистичари, сви који се баве и хуманом али и ветеринарском медицином — јер немојмо заборавити да се ради о зоонози, али и да је ветерина грана хумане медицине – би требало да нас обавесте о стању овог вируса у нашој држави. Уместо тога, све што просечан грађанин добија као одговор потиче од уско стручног кризног штаба. Зато на ова два питања јасног одговора још нема.

Хајде онда да видимо какав одговор на њих може да понуди светска литература.

Да ли је и како вирус изолован у свету?

– Јесте, али…

Вируси не могу опстати ван живе ћелије домаћина. Ово је битно за дијагностику вирусних обољења, и она је током 20. века доживљавала измене. Дијагностичка вирусологија је у експанзији од раних седамдесетих захваљујући доступности високопурификованих реагенаса и комерцијалних ћелијских линија на којима се вируси пропагирају — тј. умножавају — у ћелијској култури у лабораторији (2). Пре него што су ћелијске линије почеле да се масовно употребљавају у in vitro вирусолошке дијагностичке сврхе, вируси су узгајани in vivo, најчешће у пилећем ембриону или одраслој лабораторијској животињи (2, 4). Ова методолошка промена у дијагностици је убрзала процес вирусне изолације у значајној мери, и тај процес све бржег пропагирања, изолације и идентификације вируса се наставља и данас. Треба нагласити огроман значај који имају начин узимања узорка, количина материјала у узорку, као и транспорт узорка до лабораторије у којој се врше даље анализе. Исход изоловања вируса, као и валидност резултата теста превасходно зависе од овог низглед баналног чиниоца.

Вирус, за који се претпоставља да се налази у узорку спутума (пљувачке), назо- или оро-фарингеалног бриса особе са симптомима респираторне инфекције, се после филтрирања, инокулације и пропагације у култури ћелија – оних ћелија за које је утврђено да могу бити њиме инфициране јер поседују адекватан рецептор баш за тај вирус – се затим мора прецизно идентификовати (2, 4). За вирус SARS-CoV-2 је утврђено да се најбоље пропагира на епителним ћелијама бубрега мајмуна (Chlorocebus spp.), тзв. Vero E6 ћелијској линији (1, 3, 5). Нагласићемо да се нови вируси првобитно тестирају на више различитих ћелијских линија пре него што се утврди која од њих је пермисивна (може да буде инфицирана вирусом јер има потребне рецепторе, итд.) за тај непознати вирус.

Сада треба стати и добро погледати на који начин се идентификује један сасвим нов вирус који по први пут инфицира људе.

Идентификација вируса је потврда да су ћелије њиме инфициране, и да приликом посматрања њиховог изгледа под микроскопом оне испољавају специфичне цито-патогене ефекте. Код нових и непознатих вируса, идентификација путем посматрања цито-патогених ефеката може бити непоуздана, нарочито ако се у узорку пацијента налазе и неки други вируси. Да би се добила специфичнија идентификација новог вируса названог SARS-CoV-2 потребно је урадити серолошки тест (тј. тест у коме се користи крвни серум пацијента). У случају овог вируса то је био „тест имунофлуоресценце (IFА) на трансфектовани спајк протеин у Vero B4 ћелијама“ (5). Шта каже протокол? Вирусни спајк протеин се вештачки у лабораторији трансфектује на Vero B4 ћелије (другачије од Vero E6 које се користе за инфекцију материјалом пацијената). Тој култури ћелија се затим додаје крвни серум пацијента и тако се инкубирају под претпоставком да, уколико је пацијент био инфициран датим вирусом, антитела створена против тог вируса која се налазе у крвном серуму ће се везати за вирус у култури трансфектованих Vero B4 ћелија, и бити детектована секундарним анти-хуманим антителима везаним за флуорофору која се затим може видети под флуоресцентним микроскопом. На тај начин се ето лабораторијски покаже присуство новог вируса у инфицираним ћелијама, што је у литератури и објављено (5). Студије које наводимо врше идентификацију и помоћу директне детекције виралне мРНК путем хибридизације са олигонуклеотидним пробама. У студији је мРНК је била изолована опет из Vero E6 ћелија претходно инфицираних SARS-CoV-2 (3). Најзад, у студијама се користи и сама RT-PCR техника за потврду да је овај вирус идентификован у ћелијској култури (1, 5).

Упитно је колико је овакав вид посредне идентификације сасвим новог (непознатог) вируса специфичан. Ткође, унакрсна реактивност антитела код пацијената не може бити искључена. Као што се у једној студији и напомиње, филогенетска веза између три зоонотска коронавируса (SARS-CoV-1, MERS-CoV, SARS-CoV-2) и четири ендемска хумана коронавируса (OC43, HKU1, 229E and NL63) постоји (3).

Имајући у виду овај податак, да ли би требало да се додатно замислимо пред изјавом једног од водећих светских вирусолога, др Дидије Раул (Didier Raoult), који нас, у свом видео обраћању, обавештава о разлозима због којих сматра да су мала деца у огромном броју имуна на овај нови вирус (7)? Да се подсетимо, хумани корона вируси циркулишу редовно у вртићима и школама. Да ли би исти већ поменути податак могао да нас натера да као могући пратећи узрок (кофактор) ове пандемије узмемо у обзир и неке друге елементе? И ту се враћамо на питање с почетка овог текста које се тиче диференцијалне дијагностике.

Да ли су тестови који се у свету користе стандардизовани и шта тачно детектују?

– Јесу стандардизовани, али…

У једној од првих кинеских студија у којој је описана детекција SARS-CoV-2 у инфицираним пацијентима се каже: “Опште коришћени метод, реверзна транскрипција-ланчане рекације полимеразе (RT-PCR), садржи ограничења за употребу у клиничкој дијагностици и терапији” (6). У истој публикацији аутори тврде да се RT-PCR ипак сматра “златним стандардом за етиолошку диагностику болести CoViD-19” (6). На крају закључују да је техника прихватљива и довољно сензитивна, и да је узорак спутума дао највећу концентрацију вируса и најпоузданији резултат.  

Слично идентификацији вируса у ћелијској култури путем имунофлуоресценце, и идентификација путем RT-PCR садржи ограничења и мањкавост. У не тако давној прошлости, PCR техника се у вирусологији користила у случајевима када је неопходна брза идентификација вируса, или пак када је количина узорка добијеног од пацијента мала те захтева амплификацију (4). Међутим, у новој дијагностици, која стреми ка све бржем и бржем идентификовању, као и све већој аутоматизацији и уклањању људског фактора, ова техника је преузела примат и тренутно постала “златни стандард” за дијагностиковање SARS-CoV-2 вируса, али и других респираторних вируса. Тако постоји ‘респираторни вирусни панел’ којим се може брзо тестирати на најчешће узрочнике респиратрних инфекција. За разлику од RT-PCR теста за SARS-CoV-2, PCR респираторног панела је поузданији зато што се ради о познатим вирусима за које постоји контролни узорак и већ описана морфолошка и серолошка слика у ћелијској култури. Интересантно је, да се, колико је познато, у Србији овај респираторни панел не ради рутински на узорцима пацијената за које се сумња да могу бити заражени опасним новим SARS-CoV-2 вирусом. А зашто се не ради? Да ли је цена теста исувише висока? Да ли је у овој пандемији битно поставити тачну дијагнозу, када се зна да од ње зависи и сама терапија? Можда и није. А како се то нађе новац за куповину респиратора, али не и за диференцијално дијагностичке тестове?

Исти произвођач теста на цео панел респираторних вируса (LightMix-Modular Assays, Roche) производи и тест на SARS-CoV-2. Није ли логично да се паралелно са тестом на нови вирус ради и панел познатих респираторних вируса (хумани корона вируси (HCoV)-HKU1, -OC43, -NL63, -229E; Influenza virus A и B, Rhinovirus, Enterovirus, RSV, Human Parainfluenza virus 1-4, Human metapneumovirus, Adenovirus, and Human bocavirus RNA or DNA), као што је описано и у немачкој студији коју цитирамо (5)?

Питања је много, одговора мало. На крају, ваљало би сазнати да ли је вирус изолован у Србији, и који протокол је за то коришћен. У противном, тешко је о било чему даље расправњати на тему SARS-CoV-2. Све је упитно.

_____________________________     

Референце:

  1. La Scola, B., Le Bideau, M., Andreani, J., Hoang, V. T., Grimaldier, C., Colson, P., Gautret, P., & Raoult, D. (2020). Viral RNA load as determined by cell culture as a management tool for discharge of SARS-CoV-2 patients from infectious disease wards. European journal of clinical microbiology & infectious diseases: official publication of the European Society of Clinical Microbiology, 39(6), 1059–1061. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03913-9
  2. Leland, D. S., & Ginocchio, C. C. (2007). Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clinical microbiology reviews, 20(1), 49–78.https://doi.org/10.1128/CMR.00002-06

(3)    Ogando, N. S., Dalebout, T. J., Zevenhoven-Dobbe, J. C., Limpens, R., van der Meer, Y., Caly, L., Druce, J., de Vries, J., Kikkert, M., Bárcena, M., Sidorov, I., & Snijder, E. J.     (2020). SARS-coronavirus-2 replication in Vero E6 cells: replication kinetics, rapid adaptation and cytopathology. The Journal of general virology, 10.1099/jgv.0.001453.     Advance online publication. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001453

(4)    Virella, G.T. (1997). NMS Microbiology and Infectious Disease (3rd edition). Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.

(5) Wölfel, R., Corman, V. M., Guggemos, W., Seilmaier, M., Zange, S., Müller, M. A., Niemeyer, D., Jones, T. C., Vollmar, P., Rothe, C., Hoelscher, M., Bleicker, T., Brünink, S., Schneider, J., Ehmann, R., Zwirglmaier, K., Drosten, C., & Wendtner, C. (2020). Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature, 581(7809), 465–469.

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x

(6) Yu, F., Yan, L., Wang, N., Yang, S., Wang, L., Tang, Y., Gao, G., Wang, S., Ma, C., Xie, R., Wang, F., Tan, C., Zhu, L., Guo, Y., & Zhang, F. (2020). Quantitative Detection and Viral Load Analysis of SARS-CoV-2 in Infected Patients. Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America, ciaa345

https://doi.org/10.1093/cid/ciaa345

(7)    Dr. Didier Raoult: “Између 40% и 70% становништва, било имунизовано још пре почетка пандемије”. Фејсбук страница покрета Живим за Србију [видео].

 https://www.facebook.com/ZivimZaSrbiju/posts/595137107800811