О постојању и изолацији вируса

You are currently viewing О постојању и изолацији вируса

Скоро да не постоји студија која показује слику вируса добијену електронском микроскопијом, а која показује вирус у узорку ткива пацијената са ковид-19 дијагнозом, већ је све урађено на ВЕРО (или сличној) ћелијској линији.

Референтна литература у вези изолације SARS-CoV-2 као узрочника CoViD19

  1. Francis R, Le Bideau M, Jardot P, et al. High-speed large-scale automated isolation of SARS-CoV-2 from clinical samples using miniaturized co-culture coupled to high-content screeningClin Microbiol Infect. 2021;27(1):128.e1-128.e7. doi:10.1016/j.cmi.2020.09.018[1]
    Methods: We used an automated microscope based on high-content screening (HCS), and we applied specific image analysis algorithms targeting cytopathic effects of SARS-CoV-2 on Vero E6 cells.

КОМЕНТАР: коришћене ВЕРО ћелије за показивање присуства вируса микроскопом.

    1. Gautret P, Lagier JC, Parola P, et al. Hydroxychloroquine and azithromycin as a treatment of COVID-19: results of an open-label non-randomized clinical trial.Int J Antimicrob Agents. 2020;56(1):105949. doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.105949[2]
      Methods: For all patients, 500 μL of the liquid collected from the nasopharyngeal swab were passed through a 0.22-μm pore sized centrifugal filter (Merck millipore, Darmstadt, Ger- many), then were inoculated in wells of 96-well culture mi- croplates, of which 4 wells contained Vero E6 cells (ATCC CRL-1586) in Minimum Essential Medium culture medium with 4% fetal calf serum and 1% glutamine.

КОМЕНТАР: нема слике вируса у узорку пацијента, само рад на ВЕРО ћелијама.

  1. Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. 2020 Dec;588(7839):E35]. Nature. 2020;581(7809):465-469. doi:10.1038/s41586-020-2196-x [3]
    Methods: Virus isolation was done in two laboratories on Vero E6 cells. In brief, 100ul of suspended, cleared and filtered clinical sample was mixed with an equal volume of cell culture medium. Supernatant was collected after 0, 1, 3 and 5 days used in RT-PCR analysis. Additional technical details are provided in supplementary methods section 2a.

КОМЕНТАР: нема слике вируса у узорку пацијента, само рад ВЕРО ћелијама.

  1. Park WB, Kwon NJ, Choi SJ, et al. Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in KoreaJ Korean Med Sci. 2020;35(7):e84. Published 2020 Feb 24. doi:10.3346/jkms.2020.35.e84 [4]
    We inoculated monolayers of Vero cells (ATCC® CCL-81™) with the samples and cultured the cells at 37°C in a 5% carbon dioxide atmosphere. Until 5 days after inoculation, cytopathic effects were not distinct, which is compatible with the previous findings that no specific cytopathic effects were observed in the Vero E6 cells until 6 days after inoculation in the report about first isolation of SARS-CoV-2.

КОМЕНТАР: нема слике вируса у узорку пацијента, само рад ВЕРО ћелијама.

  1. Peng L, Liu J, Xu W, et al. SARS-CoV-2 can be detected in urine, blood, anal swabs, and oropharyngeal swabs specimens.J Med Virol. 2020;92(9):1676-1680. doi:10.1002/jmv.25936 [5]
    Method: The levels of SARS‐CoV‐2 RNA were detected by quantitative real‐time polymerase chain reaction (qRT‐PCR) using a SLAN‐96P Real‐time PCR Detection System (Hongshi, Shanghai, China). The TaqMan probe method was used with a SARS‐CoV‐2 RNA Detection Kit (SUPI‐0509; Supbio). The primers and probe were designed to detect the N gene.

КОМЕНТАР: није наведено колико циклуса ПЦР је рађено.

  1. Araujo, Danielle Bastos, Machado, Rafael Rahal Guaragna, et al.. (2020). SARS-CoV-2 isolation from the first reported patients in Brazil and establishment of a coordinated task network.Memórias do Instituto Oswaldo Cruz115, e200342. Epub October 23, 2020.https://doi.org/10.1590/0074-02760200342 [6]
    Methods: After diagnosis in patients that returned from Italy to the São Paulo city in late February by RT-PCR, SARSCoV-2 isolates were obtained in cell cultures and characterised by full genome sequencing, electron microscopy and in vitro replication properties.
    FINDINGS. The virus isolate was recovered from nasopharyngeal specimen, propagated in Vero cells (E6, CCL-81 and hSLAM), with clear cytopathic effects, and characterised by full genome sequencing, electron microscopy and in vitro replication properties.
    Virus stocks – viable (titre 2.11 × 106 TCID50/mL, titre 1.5 × 106 PFUs/mL) and inactivated from isolate SARS.CoV2/SP02.2020.

КОМЕНТАР: Изолација путем Vero Е6 ћелијске линије. Рађена отичка микроскопија за цито-патолошке ефекте, и трансмисиона електронска за потврду присуства вириона.

  1. Adriana Calderaro, Maria Cristina Arcangeletti, Flora De Conto, Mirko Buttrini, Paolo Montagna, Sara Montecchini, Francesca Ferraglia, Federica Pinardi, Carlo Chezzi, SARS-CoV-2 infection diagnosed only by cell culture isolation before the local outbreak in an Italian seven-week-old suckling baby. International Journal of Infectious Diseases, Volume 96, 2020, Pages 387-389; https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.05.035. [7] 
    On daily microscopic observation, a cytopathic effect was detected in VERO and LLC-MK2 cells at day 10 post-infection (Figure 1A–D). As a first identification level, electron microscopy of the inoculated cell supernatants after 1% formaldehyde inactivation, ultracentrifugation and negative staining, according to standard procedures (Calderaro et al., 2014), enabled the detection of viral particles belonging to the Coronaviridae family (Figure 1E).

КОМЕНТАР: коришћене ВЕРО ћелије за показивање присуства вируса микроскопом.

  1. Harcourt J, Tamin A, Lu X, et al. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United States.Emerging Infectious Diseases. 2020;26(6):1266-1273. https://doi.org/10.3201/eid2606.200516.[8]
    Comment: No cytopathic effect was observed in any of the cell lines except in Vero cells which grew to >107 PFU at 24 hours post infection.
    Methods: Vero CCL-81 cells were used for isolation and initial passage. Vero E6, Vero CCL-81, HUH 7.0, 293T, A549, and EFKB3 cells were cultured in Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) supplemented with heat inactivated fetal bovine serum (5 or 10%) and anti/anti antibiotic (GIBCO). Both NP an OP swabs were used for virus isolation. Vero cells were trypsinized and resuspended in DMEM + 10% FBS + 2X Penicillin-Streptomycin + 2X antibiotic – antimycotic + 2 X amphotericin B at 2.5 x 105 cells / ml.
    Methods: Infected Vero cells were scraped from the flask, pelleted by low speed centrifugation, rinsed with 0.1M phosphate buffer, pelleted again and fixed for 2 hours in 2.5% buffered glutaraldehyde. Specimens were post fixed with 1% osmium tetroxide, en bloc staining with 4% uranyl acetate, dehydrated and embedded in epoxy resin. Ultrathin sections were cut, stained with 4% uranylacetate and lead citrate, and examined with a Thermo Fisher/FEI Tecnai Spirit electron microscope

КОМЕНТАР: Vero CCL-81 ћелијска линија коришћена за изолацију и иницијале пасаже. Пристуство вируса затим потврђено путем PCR технике, секвенцирања и микроскопом.

  1. Stelzer-Braid S, Walker GJ, Aggarwal A, et al. Virus isolation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) for diagnostic and research purposesPathology. 2020;52(7):760-763. doi:10.1016/j.pathol.2020.09.012 [9] 
    Conclusion: Virus isolation remains an important skill to be maintained for use in diagnostic laboratories, and  is important for characterisation of emerging and existing viruses such as SARS-CoV-2. The pandemic virus SARS-CoV-2 grows to high titres in Vero/Vero E6 monkey kidney cells, and several human cell lines. While Vero and Vero E6 cells are easy to grow and infect with the virus, human cell lines may allow for study of human susceptibility to SARS-CoV-2 infection.

КОМЕНТАР: гајење вируса није урађено на хуманим ћелијским линијама ради детаљнијег проучавања.

  1. TaŞtan C, Yurtsever B, Sir KarakuŞ G, et al. SARS-CoV-2 isolation and propagation from Turkish COVID-19 patientsTurk J Biol. 2020;44(3):192-202. Published 2020 Jun 21. doi:10.3906/biy-2004-113 [10]
    Methods: The virus isolation and propagation process was started with the 96-well plate with a Vero cell line (CCl-81, ATCC) because of the low virus titer in inoculum samples (Harcourt et al. 2020). Firstly, Vero cells were trypsinized, centrifuged and suspended in virus media that is composed of DMEM high glucose (Thermo Fisher Scientific Inc.), with 2% fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific Inc.) and 1% penicillin-streptomycin-amphotericin (PSA)  solution (Pan-Biotech GmbH, Aidenbach, Germany).
    Figure 1. SARS-CoV-2 propagation and genetic confirmation. A. Images of virus propagation in Vero cell line with respect to the control Vero cell line without virus inoculation. B. Images of virus propagation in MDBK cell line along with the control MDBK cell line that was not infected with virus.

КОМЕНТАР: није урађен брис асимптоматског пацијента или здравог човека па да се то накалеми на ВЕРО ћелије?

КОМЕНТАР: коришћене ВЕРО ћелије за показивање присуства вируса микроскопом.

КОМЕНТАР: детекција вируса почиње већ код циклуса број 22 у РТ-ПЦР-у, на ВЕРО ћелијама.

  1. Jing Sun, Airu Zhu, Heying Li, Kui Zheng, Zhen Zhuang, Zhao Chen, et al.(2020) Isolation of infectious SARS-CoV-2 from urine of a COVID-19 patient, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 991-993, DOI: 10.1080/22221751.2020.1760144 [11]
    RT–PCR positive urine specimens (Ct 34) from day 12 p.i. was serially diluted in infection media and inoculated onto Vero E6 cells. Cytopathic effects (CPE) were clearly observed after 3 days (Figure 1B). Full-length viral genome sequence was acquired by next-generation sequencing (Accession number MT446312) with 5 nucleotide mutations as compared to the original Wuhan viral stain (Accession number NC045512.2) (Table S1). Cell culture supernatant was negatively stained and visualized by transmission electron microscopy (TEM). Spherical-shaped particles with distinct surface projections, resembling spikes that were consistent with SARS-CoV-2 virions as published previously (Figure 1C) were observed [1]

КОМЕНТАР: коришћене ВЕРО ћелије за показивање присуства вируса микроскопом.

КОМЕНТАР: детекција вируса почиње код циклуса број 34 у РТ-ПЦР уринa?! Добра шала

  1. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019N Engl J Med. 2020;382(8):727-733. doi:10.1056/NEJMoa2001017.[12]
    Изолација вируса из узорка брохноалвеоларне лаваже. Узорак је центрифугиран, тако да је супернатант помешан са ћелијама епитела хуманих дисајних путева (Кина, децембар 2019.). Рађена трансмисиона електронска микроскопија. Показује презумптивне вирусне честице у епителу хуманих дисајних путева (од којих jе направљена је ћелијска култура), добијених од пацијента подвргнутог хирушком захвату због рака плућа – на којима је узорак гајен in vitro. У раду се наводи да је квантитативни РТ-ПЦР рађен са бројем циклуса изнад 34!
  1. Holshue ML, DeBolt C, Lindquist S, et al. Washington State 2019-nCoV Case Investigation Team. First Case of 2019 Novel Coronavirus in the United States. N Engl J Med. 2020 Mar 5;382(10):929-936. doi: 10.1056/NEJMoa2001191.[13]
    Изолација вируса из првог случаја детектованог у САД.
    “Clinical specimens were tested with an qRT-PCR assay that was developed from the publicly released virus sequence.”
  2. Díaz FJ, Aguilar-Jiménez W, Flórez-Álvarez L, Valencia G, Laiton-Donato K et al. Isolation and characterization of an early SARS-CoV-2 isolate from the 2020 epidemic in Medellín, Colombia. Biomedica. 2020 Oct 30;40(Supl. 2):148-158. English, Spanish. doi: 10.7705/biomedica.5834. PMID: 33152198; PMCID: PMC7676823.[14]
    A nasopharyngeal specimen from a COVID-19 positive patient was inoculated on different cell lines. To confirm the presence of SARS-CoV-2 on cultures we used qRT-PCR, indirect immunofluorescence assay, transmission and scanning electron microscopy, and next-generation sequencing.
  3. Lu R, Zhao X, Li J, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020;395(10224):565-574. doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8 [15]
    Само цито-патолошке промене коришћене као дискриминанта пре секвенцирања генома. Порекло HAE (human airway epithelium) није прецизирано. Опис изолације:
    Special-pathogen-free human airway epithelial (HAE) cells were used for virus isolation. Briefly, bronchoalveolar lavage fluids or throat swabs from the patients were inoculated into the HAE cells through the apical surfaces. HAE cells were maintained in an air–liquid interface incubated at 37°C. The cells were monitored daily for cytopathic effects by light microscopy and the cell supernatants were collected for use in quantitative RT-PCR assays. After three passages, apical samples were collected for sequencing.
  4. Caly L, Druce J, Roberts J, et al. Isolation and rapid sharing of the 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) from the first patient diagnosed with COVID-19 in AustraliaMed J Aust. 2020;212(10):459-462. doi:10.5694/mja2.50569 [16]
    Изолација ове аутралијске групе се такође заснива на узгајању узорка пацијента на Vero/hSLAM ћелијској линији, и посматрању развоја цито-патогених ефеката, затим прикупљања супернатанта, фиксације и посмтрања вириона под електронским микроскопом. Дакле, све из in vitro културе ћелија не ex vivo.
    Material from the initial nasopharyngeal swab was used to inoculate a Vero/hSLAM cell line (European Collection of Authenticated Cell Cultures [ECACC] #04091501). Flasks were monitored for the development of viral cytopathic effect and 140 μL aliquots removed every 48 hours to assess virus burden by real time RT‐PCR.
    For electron microscopy, a 4 mL aliquot of supernatant from cell cultures grown in the presence of 4 μg/mL trypsin was inactivated with 0.5% glutaraldehyde for 12 h and clarified by centrifugation at 1000 g for 3 min. Supernatant was negatively stained with 3% phosphotungstic acid (pH 7.0) and examined with an FEI Tecnai T12 electron microscope at 80kV. The remaining pellet was stained en bloc and embedded in resin; 70 nm sections were examined with an FEI Tecnai F30 electron microscope at 200kV
  5. Elizondo V, Harkins GW, Mabvakure B, et al. SARS-CoV-2 genomic characterization and clinical manifestation of the COVID-19 outbreak in UruguayEmerg Microbes Infect. 2021;10(1):51-65. doi:10.1080/22221751.2020.1863747 [17]
    Уругвајска студија која објављује присуство епидемије у тој држави. Узорци из пацијената се само тестирају PCR методом и амплификован матeријал потом секвенцира.
    Naso-oropharyngeal swabs were collected in viral transport media and RNA was extracted using the QIAsymphonyⓇ DSP Virus/Pathogen Mini or Midi kit (Qiagen), respectively. Confirmatory qualitative commercial RT–PCR kits were used for diagnosis and screening (depending on critical availability during the outbreak). To amplify the viral genomes in preparation for sequencing, we used the Swift Normalase Amplicon SARS-CoV-2 Panel (SNAP, Swift Biosciences, whole viral genome single tube NGS assay, cat# SN-5XCOV296). The libraries were run on an Illumina NovaSeq 6000 300 cycle flow cell, as paired-end 150, using dual indices.

Шта је упитно код изолације SARS-CoV-2 вируса и тестова?

(Текст приредила екипа покрета Живим за Србију)

Чини се да данас обичан човек, грађанин ове државе, нема право да зна најосновније чињенице које се директно тичу његовог биолошког опстанка. Сведоци смо да и после вишемесечног готово целодневног медијског расветљавања ове посве нове ситуације из домена светског јавног здравља – како нам се представља – обичан човек све мање и мање зна и разуме шта се заправо дешава. Вируси, епидемије и пандемије су, то знамо, постојали и пре појаве SARS-CoV-2. Зашто је овај вирус страшнији и смртоноснији од других респираторних зараза још није јасно просечном грађанину Србије. Дакле, шта се то у међувремену догодило са три велике заразне пошасти човечанства, о којима се више готово и не говори: HIV-ом, туберкулозом и маларијом? Шта се догодило са другим циркулишућим респираторним инфекцијама? Да ли је диференцијална дијагностика и даље битна, или се уз нову нормалу у нашим животима полако уводи и нова дијагностика, и каквим стандардима се она руководи? Коначно, да ли је вирус природан, и ако јесте, ко је прелазни домаћин; да ли је можда природан али модификован у лабораторији, и ако јесте, како се то догодило; или је можда вештачки (рекомбинован), што је најмање вероватно? Ово су само нека од питања о којима размишља обичан човек, а на основу онога што му пласирају подједнако и мејнстрим и алтернативни медији. Поврх тих питања се накупљају и сва она која се тичу дневне егзистенције, додатно искомпликоване тренутним мерама јавног здравља.

Међутим, суштинска два питања на које се у Србији не даје јасан одговор су:

  1. Да ли је и како вирус изолован у Србији?
  2. Да ли су тестови који се у Србији користе стандардизовани, и шта тачно детектују?

Како би било нормално и лепо када би се група научника и лекара скупила и дала некакав консенсуални одговор на ова два питања. Инфектолози, микробиолози, пулмолози, епидемиолози, интернисти, биохемичари, молекуларни биолози, био-статистичари, сви који се баве и хуманом али и ветеринарском медицином – јер немојмо заборавити да се ради о зоонози, али и да је ветерина грана хумане медицине – би требало да нас обавесте о стању овог вируса у нашој држави. Уместо тога, све што просечан грађанин добија као одговор потиче од уско стручног кризног штаба. Зато на ова два питања јасног одговора још нема. Хајде онда да видимо какав одговор на њих може да понуди светска литература.

Да ли је и како вирус изолован у свету?

– Јесте, али…

Вируси не могу опстати ван живе ћелије домаћина. Ово је битно за дијагностику вирусних обољења, и она је током 20. века доживљавала измене. Дијагностичка вирусологија је у експанзији од раних седамдесетих захваљујући доступности високопурификованих реагенаса и комерцијалних ћелијских линија на којима се вируси пропагирају – тј. умножавају – у ћелијској култури у лабораторији (2). Пре него што су ћелијске линије почеле да се масовно употребљавају у in vitro вирусолошке дијагностичке сврхе, вируси су узгајани in vivo, најчешће у пилећем ембриону или одраслој лабораторијској животињи (2, 4). Ова методолошка промена у дијагностици је убрзала процес вирусне изолације у значајној мери, и тај процес све бржег пропагирања, изолације и идентификације вируса се наставља и данас. Треба нагласити огроман значај који имају начин узимања узорка, количина материјала у узорку, као и транспорт узорка до лабораторије у којој се врше даље анализе. Исход изоловања вируса, као и валидност резултата теста превасходно зависе од овог наизглед баналног чиниоца. Вирус, за који се претпоставља да се налази у узорку спутума (пљувачке), назо- или оро-фарингеалног бриса особе са симптомима респираторне инфекције, се после филтрирања, инокулације и пропагације у култури ћелија – оних ћелија за које је утврђено да могу бити њиме инфициране јер поседују адекватан рецептор баш за тај вирус – се затим мора прецизно идентификовати (2, 4). За вирус SARS-CoV-2 је утврђено да се најбоље пропагира на епителним ћелијама бубрега мајмуна (Chlorocebus spp.), тзв. Vero E6 ћелијској линији (1, 3, 5). Нагласићемо да се нови вируси првобитно тестирају на више различитих ћелијских линија пре него што се утврди која од њих је пермисивна (може да буде инфицирана вирусом јер има потребне рецепторе, итд.) за тај непознати вирус. Сада треба стати и добро погледати на који начин се идентификује један сасвим нов вирус који по први пут инфицира људе.  Идентификација вируса је потврда да су ћелије њиме инфициране, и да приликом посматрања њиховог изгледа под микроскопом оне испољавају специфичне цито-патогене ефекте. Код нових и непознатих вируса, идентификација путем посматрања цито-патогених ефеката може бити непоуздана, нарочито ако се у узорку пацијента налазе и неки други вируси. Да би се добила специфичнија идентификација новог вируса названог SARS-CoV-2 потребно је урадити серолошки тест (тј. тест у коме се користи крвни серум пацијента). У случају овог вируса то је био „тест имунофлуоресценце (IFА) на трансфектовани спајк протеин у Vero B4 ћелијама“ (5). Шта каже протокол? Вирусни спајк протеин се вештачки у лабораторији трансфектује на Vero B4 ћелије (другачије од Vero E6 које се користе за инфекцију материјалом пацијената). Тој култури ћелија се затим додаје крвни серум пацијента и тако се инкубирају под претпоставком да, уколико је пацијент био инфициран датим вирусом, антитела створена против тог вируса која се налазе у крвном серуму ће се везати за вирус у култури трансфектованих Vero B4 ћелија, и бити детектована секундарним анти-хуманим антителима везаним за флуорофору која се затим може видети под флуоресцентним микроскопом. На тај начин се ето лабораторијски покаже присуство новог вируса у инфицираним ћелијама, што је у литератури и објављено (5). Студије које наводимо врше идентификацију и помоћу директне детекције виралне мРНК путем хибридизације са олигонуклеотидним пробама. У студији је мРНК је била изолована опет из Vero E6 ћелија претходно инфицираних SARS-CoV-2 (3). Најзад, у студијама се користи и сама RT-PCR техника за потврду да је овај вирус идентификован у ћелијској култури (1, 5). Упитно је колико је овакав вид посредне идентификације сасвим новог (непознатог) вируса специфичан. Тaкође, унакрсна реактивност антитела код пацијената не може бити искључена. Као што се у једној студији и напомиње, филогенетска веза између три зоонотска коронавируса (SARS-CoV-1, MERS-CoV, SARS-CoV-2) и четири ендемска хумана коронавируса (OC43, HKU1, 229E and NL63) постоји (3).

Имајући у виду овај податак, да ли би требало да се додатно замислимо пред изјавом једног од водећих светских вирусолога, др Дидије Раул (Didier Raoult), који нас, у свом видео обраћању, обавештава о разлозима због којих сматра да су мала деца у огромном броју имуна на овај нови вирус (7)? Да се подсетимо, хумани корона вируси циркулишу редовно у вртићима и школама. Да ли би исти већ поменути податак могао да нас натера да као могући пратећи узрок (кофактор) ове пандемије узмемо у обзир и неке друге елементе? И ту се враћамо на питање с почетка овог текста које се тиче
диференцијалне дијагностике.

Да ли су тестови који се у свету користе стандардизовани и шта тачно детектују?
– Јесу стандардизовани, али…

У једној од првих кинеских студија у којој је описана детекција SARS-CoV-2 у инфицираним пацијентима се каже: „Опште коришћени метод, реверзна транскрипција-ланчане реакције полимеразе (RT-PCR), садржи ограничења за употребу у клиничкој дијагностици и терапији“ (6). У истој публикацији аутори тврде да се RT-PCR ипак сматра „златним стандардом за етиолошку дијагностику болести CoViD-19“ (6). На крају закључују да је техника прихватљива и довољно сензитивна, и да је узорак спутума дао највећу концентрацију вируса и најпоузданији резултат. Слично идентификацији вируса у ћелијској култури путем имунофлуоресценце, и идентификација путем RT-PCR садржи ограничења и мањкавост. У не тако давној прошлости, PCR техника се у вирусологији користила у случајевима када је неопходна брза идентификација вируса, или пак када је количина узорка добијеног од пацијента мала те захтева амплификацију (4). Међутим, у новој дијагностици, која стреми ка све бржем и бржем идентификовању, као и све већој аутоматизацији и уклањању људског фактора, ова техника је преузела примат и тренутно постала „златни стандард“ за дијагностиковање SARS-CoV-2 вируса, али и других респираторних вируса. Тако постоји ‘респираторни вирусни панел којим се може брзо тестирати на најчешће узрочнике респираторних инфекција. За разлику од RT-PCR теста за SARS-CoV-2, PCR респираторног панела је поузданији зато што се ради о познатим вирусима за које постоји контролни узорак и већ описана морфолошка и серолошка слика у ћелијској култури. Интересантно је, да се, колико је познато, у Србији овај респираторни панел не ради рутински на узорцима пацијената за које се сумња да могу бити заражени опасним новим SARS-CoV-2 вирусом. А зашто се не ради? Да ли је цена теста исувише висока? Да ли је у овој пандемији битно поставити тачну дијагнозу, када се зна да од ње зависи и сама терапија? Можда и није. А како се то нађе новац за куповину респиратора, али не и за диференцијално дијагностичке тестове?

Исти произвођач теста на цео панел респираторних вируса (LightMix-Modular Assays, Roche) производи и тест на SARSCoV-2. Није ли логично да се паралелно са тестом на нови вирус ради и панел познатих респираторних вируса (хумани корона вируси (HCoV)-HKU1, -OC43, -NL63, -229E; Inéuenza virus A и B, Rhinovirus, Enterovirus, RSV, Human Parainéuenza virus 1-4, Human metapneumovirus, Adenovirus, and Human bocavirus RNA or DNA), као што је описано и у немачкој студији коју цитирамо (5)?

Питања је много, одговора мало. На крају, ваљало би сазнати да ли је вирус изолован у Србији, и који протокол је за то коришћен. У противном, тешко је о било чему даље расправљати на тему SARS-CoV-2. Све је под знаком питања.

  1. La Scola, B., Le Bideau, M., Andreani, J., Hoang, V. T., Grimaldier, C., Colson, P., Gautret, P., & Raoult, D. (2020). Viral RNA load as determined by cell culture as a management tool for discharge of SARS-CoV-2 patients from infectious
    disease wards. European journal of clinical microbiology & infectious diseases: ofècial publication of the European Society of Clinical Microbiology, 39(6), 1059-1061. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03913-9
  2. Leland, D. S., & Ginocchio, C. C. (2007). Role of cell culture for virus detection in the age of technology. Clinical microbiology reviews, 20(1), 49-78.https://doi.org/10.1128/CMR.00002-06
  3. Ogando, N. S., Dalebout, T. J., Zevenhoven-Dobbe, J. C., Limpens, R., van der Meer, Y., Caly, L., Druce, J., de Vries, J.,Kikkert, M., Bárcena, M., Sidorov, I., & Snijder, E. J. (2020). SARS-coronavirus-2 replication in Vero E6 cells: replication
    kinetics, rapid adaptation and cytopathology. The Journal of general virology, 10.1099/jgv.0.001453. Advance online https://doi.org/10.1099/jgv.0.001453
  4. Virella, G.T. (1997). NMS Microbiology and Infectious Disease (3rd edition). Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.
  5. Wölfel, R., Corman, V. M., Guggemos, W., Seilmaier, M., Zange, S., Müller, M. A., Niemeyer, D., Jones, T. C., Vollmar, P.,Rothe, C., Hoelscher, M., Bleicker, T., Brünink, S., Schneider, J., Ehmann, R., Zwirglmaier, K., Drosten, C., & Wendtner, C. (2020).Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature, 581(7809), 465-469. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x
  6. Yu, F., Yan, L., Wang, N., Yang, S., Wang, L., Tang, Y., Gao, G., Wang, S., Ma, C., Xie, R., Wang, F., Tan, C., Zhu, L., Guo, Y., &Zhang, F. (2020). Quantitative Detection and Viral Load Analysis of SARS-CoV-2 in Infected Patients. Clinical infectious diseases. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa345
  7. Didier Raoult: „Између 40% и 70% становништва, било имунизовано још пре почетка пандемије“. Фејсбук страница покрета Живим за Србију [видео]. https://www.facebook.com/ZivimZaSrbiju/posts/595137107800811